HiFi One-Step RT-PCR Mix(電泳)試劑本試劑采用穩(wěn)定高效的RT-PCR預(yù)混體系，是以RNA為模板進(jìn)行一步法RT-PCR的專用試劑。其原理為用基因特異性引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得第一鏈cDNA（不可使用Oligo（dT）或Random Rimer合成第一鏈cDNA），再使用基因特異性正向引物和反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在同一反應(yīng)體系中一步完成從反轉(zhuǎn)錄到PCR的全部過程。反應(yīng)體系中已含有電泳所需的指試劑（藍(lán)色和黃色），反應(yīng)后可以直接進(jìn)行電泳。

在本試劑中，將耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Rnase Inhibitor、Hotstart高保真DNA聚合酶以及穩(wěn)定劑等配制成50×One-Step Enzyme Mix預(yù)混液；反應(yīng)Buffer、dNTP以及電泳指示染料配制成5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer，因此使得操作更加簡(jiǎn)單便，擴(kuò)增產(chǎn)物可用于平端克隆和DNA測(cè)序。

組分

組分名稱250T

50×One-Step Enzyme Mix100 μl

5×HiFi One-Step RT-PCR Buffer1 ml

RNase Free H2O1 ml×3

注意：1.50×One-Step Enzyme Mix粘度高，第一次使用之前要離心收集至反應(yīng)管底部，吸取時(shí)應(yīng)緩慢小心。

2.由于使用了Hotstart高保真DNA聚合酶，反應(yīng)配制可在常溫進(jìn)行，但各組分應(yīng)-20°C保存。

主要特征

耐熱M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶可在55℃反應(yīng)能更好的打開復(fù)雜二級(jí)結(jié)構(gòu)，只需10min即可完成逆轉(zhuǎn)錄。

DNA聚合酶為熱啟動(dòng)型高保真酶，能夠有效的抑制非特異性反應(yīng)且具有較高的校正活性，酶激活僅需2min。

具有寬泛的模板量兼容性，10 ng~1μg都可有效擴(kuò)增。

反應(yīng)過程中無需開蓋，避免了操作過程中的污染危害。

儲(chǔ)存

請(qǐng)置于-20°C，可保存2年；避免反復(fù)凍融。

恒溫?cái)U(kuò)增使用策略及實(shí)例展示

應(yīng)用實(shí)例1：在以A3824-03或 A3828-03，用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。Bst4.0 SYBR Green試劑可在標(biāo)準(zhǔn)定量PCR

儀或恒溫?zé)晒鈨x上進(jìn)行反應(yīng)。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，

NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)25min的檢測(cè)結(jié)果，可以看到檢測(cè)反應(yīng)<20min(達(dá)平臺(tái)期)。

應(yīng)用實(shí)例2： 用 LP1002引物組進(jìn)行的LAMP測(cè)試。OG變色法為終點(diǎn)變色策略，在反應(yīng)結(jié)束后，倒置反應(yīng)管，溶解管蓋上染料后，陽性樣本呈現(xiàn)出醒目的綠色，陰性表現(xiàn)出橙色，區(qū)分明顯。且該方法不受樣本類型限制，雜質(zhì)耐受性很好。以體外轉(zhuǎn)錄RNA為模板，1-6分別為1、10、100、1000、10e4和10e6Copies，NTC為ddH2O為模板。下圖為65℃反應(yīng)20min后檢測(cè)結(jié)果。

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